新品发布丨华纳生物寡核苷酸合成试剂上新啦！

合肥华纳隆重推出寡核苷酸合成试剂，包括各种配方的脱保护剂、活化剂、加帽剂、氧化剂以及符合标准含水量的乙腈。能满足用户在药物基因组学、诊断方法和药物开发等应用方面的需求，广泛用于实验室及批量生产规模的DNA/RNA 合成。欢迎新老客户咨询！

寡核苷酸合成试剂知多少

固相合成方法自1987年被Marvin H. Ca ruthers发明之后，因其具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点，被广泛应用于分子生物学及医药研究等领域，目前已成为一项较为成熟的寡核苷酸合成方法。

不同于酶促反应从5'端→3'端方向延伸的合成过程，固相亚磷酰胺法合成是由3'端开始。在合成过程中除合成柱、核苷单体外，还需要用到合成辅助试剂：如脱保护剂、活化剂、加帽剂等等。今天我们一起来了解，在每一步反应中合成试剂的种类及作用。

一、脱保护（Deblocking）反应

脱保护反应中使用三氯乙酸（TCA）去除核苷5'端位置上的 DMT保护基团，从而在5'端产生活性基团（-OH），以便于进行后续的偶联反应。

图1. 脱保护过程示意图

此步骤中会使用到脱保护试剂：二氯乙酸或三氯乙酸/二氯甲烷，二氯甲烷作为溶剂存在，二氯乙酸或三氯乙酸的浓度为3%，与核苷作用，使其产生活性基团（-OH）用于下一步偶联反应。脱保护反应完成后，使用乙腈洗涤去除残留的脱保护剂，以防止脱保护剂残留产生杂质。

二、偶联（Coupling）反应

偶联反应发生之前，需先将下一个亚磷酰胺单体与四氮唑（催化剂）混合后置入合成柱，四氮唑的作用是将3'端磷酸基团位置上的二异丙胺基质子化，也称为活化。随后，脱保护反应中产生的活性基团（-OH）会与活化后的四唑中间体结合，形成新的磷氧键，并脱去四唑。

图2. 偶联过程示意图

此步骤中会使用到活化剂：5-乙巯基四氮唑/乙腈。四氮唑的作用是与核酸的亚磷酰胺单体反应生成活性中间体。

三、加帽（Capping）反应

加帽主要是为了防止未参与上一阶段循环的活性基团（-OH）在新的循环中与新加入的亚磷酰胺单体发生偶联，产生短链杂质。此步骤之前常使用加帽剂对未参与反应的活性基团（-OH）进行端口封闭，避免其干扰下一轮循环。反应过程十分迅速，通常几秒即可（这是因为需要加帽的活性基团（-OH）比较少，乙酰化试剂的活性高且过量）。太长的加帽时间会增加在非预期位置发生乙酰化反应的可能性，增加乙酸酐与水形成酸攻击新生成的亚磷酯键的危险性。

图3. 加帽过程示意图

此步骤中会使用到加帽剂，加帽剂分为2种，使用之前分开存放。加帽试剂A（CapA），为醋酸酐；加帽试剂B（CapB）为N-甲基咪唑，作为酰化反应的催化剂。二者混合后会形成活性很强的活性试剂。

四、氧化（Oxidizing）反应

偶联之后新的核苷酸通过亚磷酯键与寡核苷酸链相连，亚磷酯键不稳定且易被酸碱水解破坏，因此需要被氧化成稳定的五价的磷。被氧化后的磷酸二酯键在原有的磷酸二酯键外会多出一个2-氰乙基保护，使得其在后续的延伸过程中更加稳定。氧化过程通常采用碘的四氢呋喃溶液作为氧化剂，氧化结束后，延伸得到的寡核苷酸链继续进行下一轮循环，直至链延伸至所需的长度。

图4. 氧化过程示意图

注：图1-4合成过程参考文献：Large-scale de novo DNA synthesis: technologies and applications.

氧化反应步骤中会使用到氧化剂，常用的氧化剂为碘的四氢呋喃和吡啶、水的混合溶液，作用是将亚磷酰胺中间体转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。

当寡核苷酸链经过以上四个步骤的多次循环达到所需的长度时，将合成的寡核苷酸链从固相载体上切割下来，之后仍需对其进行纯化方能获得成品。

在上述合成反应中用到合成试剂需经过特殊的纯化工艺，满足含水量、纯度等技术指标，确保优异的合成效率。所有的合成试剂也都要经过严格的过滤，减少固体微粒的污染。在合成过程中选择高品质的合成试剂，也是寡核苷酸合成过程中高纯度和高耦合效率的保障之一。

关于华纳生物

合肥华纳生物医药科技有限公司成立于2017年，致力于提供修饰性核苷、核苷酸、亚磷酰胺基因单体和荧光染料系列有关产品的研产销一体化解决方案。公司在合肥循环经济示范园建立了GMP标准现代化生产基地。已经通过多家国内外头部企业的审计检查。可以高质量长期稳定供应吨级产品，确保客户供应链安全。